图文来源：Adherent cell thawing by infrared radiation，2021年12月发表于 Cryobiology》
一、导读
在冷冻保存过程中，细胞可能会失去其原有的细胞外基质，细胞与细胞之间的联系会被破坏，黏附细胞可能会从其基质上脱落。
很多研究已经研究了黏附细胞的冷冻保存，而解冻速率与黏附细胞冷冻保存关系的研究较少，尤其对于慢速冷冻，解冻速率的影响更不明确，缺乏比较快速解冻和普通水浴（Water Bath, WB）解冻方法对附着在基质上的细胞的研究。
本文提出了一种2000-30000℃/min加速解冻样品的方法。该系统通过控制样品在红外（IR）照射区的时间，使样品以可控的方式解冻，并从冷冻状态突然过渡到解冻和温暖的条件。研究者建立了一个系统，使完整的细胞能够被冷冻和解冻，同时保持在一个基底上。该装置的主要特点见图1。
图1：红外辅助解冻装置的示意图。样品被放在一个旋转臂上，通过照明光束几秒钟。
二、材料和研究方法
实验使用了异质性人类上皮性结直肠腺癌（Caco2）和视网膜色素上皮（RPE）细胞系。让两个细胞系生长到70%-80%汇合，在含有5%二氧化碳的37℃湿润培养箱中培养。
冻存
冷冻培养基是由10%的Me2SO和10%的胎牛血清（FBS，fetal bovine serum）在低糖杜氏改良Eagle培养基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM）中组成。细胞-基质复合物的低温保存是使用可控速率的冷冻机（Asymptote-EF600; Grant Instruments, Cambridgeshire, UK）以1℃/min的冷却速率进行的，直到达到7℃的温度；然后，使用无菌冷钳在7℃对样品进行人工冰核（"播种"），并以相同速率进一步冷却到80℃。所有低温保存的样本都在80℃储存，直到使用为止。
WB解冻
在37℃的水浴中解冻冷冻的附着细胞-基质样品，方法是将样品放入水浴中而不浸没它们。
IR解冻
冻住的细胞-基质样品使用红外加热灯（SpotIR, Precision Control Systems, USA）进行解冻，该灯的最大功率为750W，灯丝温度为2500K（2227℃）。样品被放置在一个旋转平台上。
暖化后的程序
IR解冻后，取出样品，在37℃的预热的Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水（DPBS）中清洗细胞。WB解冻过程类似。
三、结果
细胞存活率
使用二乙酸荧光素/碘化丙啶（FDA/PI）活细胞和死细胞成像法来分析附着在表面的细胞的解冻后活力。如图3所示，样品体积为200μL的条件下，经1s红外照射解冻的附着细胞显示出最高的细胞活力，1s红外照射的Caco2和RPE细胞的平均活力分别为80%和86%。对于WB解冻，Caco2和RPE细胞的细胞活力分别为58%和60%。
图3 不同解冻方法的RPE和Caco2细胞的生存能力。
细胞附着
为了有效地低温保存细胞播种的基质，细胞必须保持附着在基质的表面。本实验观察到使用WB解冻的附着细胞的数量明显减少，24小时后只有20%的细胞仍然附着，同等条件下，超过70%的1s IR解冻样品仍然附着。
细胞增殖
在解冻后的七天内监测基质附着细胞的增殖。使用MTT染料在第1、3和7天测量细胞增殖。观察到，使用WB时的细胞增殖率低于使用最佳剂量的红外辐射时的增殖率（图5）。虽然在第3天和第7天，WB解冻的样品与解冻的样品相比，细胞增殖率明显下降，但红外辅助解冻后的细胞增殖率与解冻样品相当（图5）。
图5 RPE和Caco2细胞的MTT结果
细胞骨架分析
F-肌动蛋白在维持细胞的完整性方面起着重要作用，是影响细胞功能的一个关键因素。与使用红外辐射解冻的样品相比，在WB中解冻的两种类型的细胞中，肌动蛋白被扭曲，表现为染色的减少。将红外解冻的样品和WB解冻的样品与未冷冻的样品进行比较，发现红外解冻的细胞中肌动蛋白的荧光与未冷冻的细胞相似。
四、结论
这项研究概述了一种通过强烈的红外光束快速解冻生物样品的独特方法。对冷冻保存的细胞的相关恢复进行了调查，发现与水浴解冻相比，细胞的恢复效果更好，并减少了从基质上的脱落，研究者预计这项研究的扩展将使组织、器官、球状体和器官成功地保存在芯片上，从而为医疗诊断和治疗提供新的机会。
