粪便是进行人类和动物肠道微生物菌群分析最常使用的样本，其储存条件有可能给微生物的活性和组成带来实质性的改变，影响粪便微生物菌群的下游应用和分析。将粪便冷冻存储在-80°C条件下，是临床和研究（尤其是大规模的队列研究）中的一种切实可行、简单的方法，而冷冻后粪便中细菌的活性在数量和组成上还没有得到充分的证明。
上海交通大学生命科学技术学院的庞小燕团队，使用了基于PMA（propidium monoazide，一种红色荧光染料）的方法来评估冷冻存储的人类粪便样本的微生物活力，相关论文以“Cryopreservation of stool samples altered the microbial viability quantitively and compositionally”为题发表在《Archives of Microbiology》上。
上海交通大学生命科学技术学院的庞小燕团队，使用了基于PMA（propidium monoazide，一种红色荧光染料）的方法来评估冷冻存储的人类粪便样本的微生物活力，相关论文以“Cryopreservation of stool samples altered the microbial viability quantitively and compositionally”为题发表在《Archives of Microbiology》上。
储存后的粪便样本中的活菌数
研究者测量了不同储存方式下微生物群中活菌的比例（图1），在冻融（freeze-thawing, FT）或短期室温存储（room temperature, RT）后，该比例明显下降。
图1. 使用16S rRNA基因测序，qPCR，并结合PMA处理技术得出的活菌比例。（a）3个人（H1，H2和H3）的活菌比例。（b）新鲜样品（F）、冻融样品（FT）、短期室温存储样品（RT）的活菌比例。
活性微生物群的多样性和结构变化
与新鲜样本（F）相比，冻融样本（FT）中活菌的香农指数（Shannon index）没有明显改变。短期室温存储样品（RT）与新鲜样本（F）相比，α多样性降低了，而降低的程度显示了个体差异（图2a，b）。每个人都有独特的微生物组结构，个体差异性是微生物组成的主要驱动因素（图2c），这一点被MANOVA检验进一步证实（图2d）。
图2. 储存条件对活体微生物群多样性和结构的影响。（a）基于每个个体的香农指数（Shannon index）的α多样性。（b）基于新鲜样品（F）、冻融样品（FT）和短期室温存储样品（RT）的香农指数（Shannon index）的α多样性。（c）基于布雷柯蒂斯距离（Bray Curtis Distance）的主坐标分析（PCoA，principal coordinate analysis）。（d）基于布雷柯蒂斯距离的样品聚类，使用前3个主成分（占总变化的85.5%）进行MANOVA计算。门和属级活性微生物群的变化
三个人的肠道微生物群主要由Firmicutes、Bacteroidetes、Actinobacteria和Proteobacteria菌门组成（图3a）。在属级别，图3b描述了相对丰度超过1%的类群，它们由于FT或RT的处理差异显示出个体差异。线性判别分析（LEfSe）模型被用来寻找关键属（图3c）。当比较RT与F时，研究发现Escherichia-Shigella、Enterococcus和Lactococcus这三类菌属在F样本中相对丰度都很低，在RT中则有所增加（图3）。
图3. 冻融（FT）和短期室温存储（RT）后活菌相对丰度的变化。（a）门级。（b）属级（仅显示相对丰度>1%的属）。（c）通过LEfSe确定的与存储条件明显相关的属。存储后活性ASVs（扩增子序列变异）发生变化
根据LEfSe与成对比较，选择相对丰度超过0.05%的ASVs。当比较FT和F时，研究发现了21个ASVs（图4a），其中11个ASVs在FT中增加，10个ASVs在FT中减少。大多数增加的ASVs与革兰氏阳性菌具有高度的系统发育同源性。当对RT和F进行比较时（图4b），只发现ASV 14在RT中增加。
图4. 存储条件对ASV水平的影响。（a）与F相比，21个ASVs与FT明显相关。热图显示了两组ASVs的丰度。（b）左侧显示了与F相比，11个ASVs与RT显著相关。热图显示了两组中ASVs的丰度。
讨论
本研究发现冷冻存储和室温储存都显著降低了活菌的比例。研究者认为，对于冷冻存储的样本，活菌的损失主要是由于冷冻过程中细胞内冰晶的形成和生长，以及膜破裂和渗透压力造成的损害导致的，而对于室温条件下储存的样本，由于粪便样本大多含有严格的厌氧菌，暴露于氧气会导致这些厌氧微生物的死亡。
一些防腐缓冲剂如乙醇、RNAlater和Tris-EDTA被引入存储粪便样本，但人们发现它们会导致微生物群组成的变化，此外，使用这些缓冲液将限制后续样品的使用。研究者仍然推荐在-80℃下快速冷冻作为粪便储存的方法。
文章来源：
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35972563/
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