代谢组学反映生物体内各种生命活动影响的最终结果和表现形式。在长期收集临床样本的过程中，分析前因素会影响代谢组学分析的结果，冷冻时间延迟就是其中一个关键因素，它可能会大大影响研究结果。
在针对组织样本的代谢组学研究中，代谢组学过程被标准化和具体化，但预处理过程并不严格，对组织分离时间的描述也缺乏严谨性，代谢组学研究的结论有可能不可靠。因此，南京大学医学院附属口腔医院泥艳红/胡勤刚教授团队通过处理来自5名口腔鳞癌（OSCC）患者的160个样本，系统地研究了代谢物的稳定性，相关研究以“Impact of preanalytical freezing delay time on the stability of metabolites in oral squamous cell carcinoma tissue samples”为题发表在《Metabolomics》上。
实验流程如图1所示。
图1. 本实验的总体设计。a 结扎舌头组织的最后一条供血血管，切断血液供应。b 外科医生观察肿瘤切除状况，根据治疗指南切开手术边缘。c 样品采集。d 样品保存在冰上（步骤b-d的样品在冰上）。e 质谱分析前的样品处理和病理染色前的处理。f 质谱分析和病理染色。
图1. 本实验的总体设计。a 结扎舌头组织的最后一条供血血管，切断血液供应。b 外科医生观察肿瘤切除状况，根据治疗指南切开手术边缘。c 样品采集。d 样品保存在冰上（步骤b-d的样品在冰上）。e 质谱分析前的样品处理和病理染色前的处理。f 质谱分析和病理染色。
延迟冷冻时间对整体代谢谱没有明显的系统影响
研究者用液相色谱-质谱联用技术（LC-MS/MS）分析了延迟冷冻时间对肿瘤组织和正常组织中整体代谢物的影响。结果显示，肿瘤组织和匹配的正常组织中，不同的病人样本有明显的聚类，但不同的冷冻时间（30-120分钟）并没有明显聚类（图2a, b）。此外，肿瘤组织显示出良好的样本内一致性，而正常组织样本的一致性稍差。口腔鳞癌（OSCC）和正常样本中的代谢物与相应的患者样本密切聚类，但与不同的冷冻时间（30-120分钟）无关（图2c，d）。组织样本从30到120分钟没有发生动态变化（图2e，f和图4）。这些结果表明，组织样本的差异比延迟冷冻时间的变化对代谢谱（metabolic profle）影响更大。
图2. 延迟冷冻对代谢组学没有系统性影响。a, b 口腔鳞癌（OSCC）患者的正常组织。（a）和肿瘤组织（b）的分子代谢特征热图。热图顶部的注释显示了样本的聚类。c, d 主成分分析（PCA）图描述了正常组织和肿瘤组织中主成分的比例。数据点的形状代表组织（患者A-E），其大小代表延迟冷冻时间（30-120分钟）。e, f 不同延迟冷冻时间的PCA。图中只显示了30和120分钟的得分图，两个时间点的得分图是聚类的。g, h limma包分析结果。（g）（正常组织）和（h）（肿瘤组织）中的绿框表示可能有代谢物上调或下调的情况。
延迟冷冻时间下肿瘤组织和正常组织的动态代谢物表达谱
研究者总共观察到8个不同的时间模式聚类，这些聚类代表了不同调节的代谢物，表明不同的表达动力学（图3a，d）。不同延迟冷冻时间的代谢物浓度出现规律的变化。在肿瘤组织和正常组织中，聚类1和聚类10分别与时间表现出高度正相关和高度负相关（图3b，e）。图3c、f表明两种分析方法的结果具有高度的一致性。结果表明，在延迟冷冻的条件下，一些代谢物的浓度确实随着延迟冷冻时间的延长而增加或减少。
图3. 随着冰冻时间的延迟，代谢物表达的时间分布情况。a, d 模糊c-均值聚类（FCM）确定了正常组织（a）和肿瘤组织（d）中代谢物表达的八个不同时间模式。X轴代表体外延迟冷冻时间，Y轴代表每个时间点的归一化强度比。b, e 研究人员通过分层聚类对正常组织（b）和肿瘤组织（e）中代谢物的表达模式进行分类。X轴代表体外延迟冷冻时间，Y轴代表每个时间点的归一化强度比。
图3. 随着冰冻时间的延迟，代谢物表达的时间分布情况。a, d 模糊c-均值聚类（FCM）确定了正常组织（a）和肿瘤组织（d）中代谢物表达的八个不同时间模式。X轴代表体外延迟冷冻时间，Y轴代表每个时间点的归一化强度比。b, e 研究人员通过分层聚类对正常组织（b）和肿瘤组织（e）中代谢物的表达模式进行分类。X轴代表体外延迟冷冻时间，Y轴代表每个时间点的归一化强度比。延迟冷冻时间对120分钟内单一代谢物浓度变化的影响
延迟冷冻时间达120分钟时，正常组织中有20%的代谢物与时间有明显的相关性（P值<0.05）（图4a），肿瘤组织中有近20%的代谢物与时间有明显相关性（P值<0.05）（图4b）。延迟冷冻时间内可能会发生活跃的代谢（图4c，d）。正常组织中的第1聚类和肿瘤组织中的第1聚类与时间表现出高度的相关性（图4e，f）。
图4. 在延迟冷冻的长达120分钟内发生明显变化的代谢物列表。a, b 通过火山图（过滤聚类）分别显示正常组织和肿瘤组织之间具有高度时间相关性和明显差异的代谢物；c, d 是（a, b）中具有明显差异的代谢物的热图显示；e, f 显示这些代谢物的不同变化趋势。
延迟冷冻时间对60分钟内或60分钟外单个代谢物的影响
研究者在组织供血被切断前60分钟进行了进一步分析，发现在正常组织以及肿瘤组织中，不同聚类的代谢物表达不同，且延迟冷冻时间在30-60 min期间对代谢物的影响与30-120 min期间不同（图5)，这说明代谢物在不同时间段也表现出不同程度的变化。
图5. 代谢物表达的时间分布图。a, b 正常组织中延迟冷冻时间为30-60分钟（a）和延迟冷冻时间为70-120分钟（b）的五种不同时间模式的代谢物表达。c, d 肿瘤组织中延迟冷冻时间为30-60分钟（c）和延迟冷冻时间为70-120分钟（d）的五种不同时间模式的代谢物表达。X轴代表体外延迟冷冻时间，而Y轴代表每个时间点的归一化强度比值。
图6. 组织冷冻方案。a-g 左图是代谢物随时间变化趋势的总结，中图是典型代谢物的例子（●、■、▲、▼和◆分别代表病人A、B、C、D和E）。右图是符合左图模型的代谢物（根据P值列出所有代谢物或前10个代谢物）。
图5. 代谢物表达的时间分布图。a, b 正常组织中延迟冷冻时间为30-60分钟（a）和延迟冷冻时间为70-120分钟（b）的五种不同时间模式的代谢物表达。c, d 肿瘤组织中延迟冷冻时间为30-60分钟（c）和延迟冷冻时间为70-120分钟（d）的五种不同时间模式的代谢物表达。X轴代表体外延迟冷冻时间，而Y轴代表每个时间点的归一化强度比值。
组织冷冻的实验方案
研究者根据代谢物对延迟冷冻时间的敏感性提出冷冻方案，为组织代谢研究提供最佳组织采集时间（图6）。冷冻方案I：组织在被分离后应在最短的时间内用液氮冷冻（IA，IB，IC和ID）；冷冻方案二：组织应在60分钟内用液氮体外冷冻（IIA和IIB）；冷冻方案三：应在120min内用液氮冷冻组织（III）。
结论
研究者认为，（1）延迟冷冻对整个代谢谱没有明显影响；（2）一些代谢物的稳定性受到延迟冷冻的影响；（3）在研究对延迟冷冻敏感的代谢物时，可以将组织冷冻方案作为参考。
文章来源：
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36282338/
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