干细胞在生物学领域被广泛研究，它们在再生医学和治疗方面的潜力正受到越来越多的关注。冷冻保存已成为大多数实验和临床方案（包括干细胞移植）中的一项不可或缺的技术，它保持了细胞从采集、运输到最终植入的质量，同时没有丧失至关重要的解剖和生理特性。
此外，干细胞培养和老化过程中的多次传代可能导致细胞分化潜能的降低和基因改变，冷冻保存成为一种可靠的技术，可防止这些有害影响。
因此，探讨干细胞的冷冻保存及其制备方法，以建立医学细胞或组织库以及开发临床再生医学，是极为重要的。通过分析细胞冷冻损伤的机制和优化现有的冷冻技术，开发干细胞冷冻保存的新方法，也是当务之急。
中南大学湘雅药学院的谭淞文教授团队概述了干细胞冷冻保存过程中遇到的主要冷冻损伤及其处理方法，讨论了临床应用中干细胞制剂细胞毒性的影响因素、其生物安全性问题以及最近在质量评估中使用的技术。相关文章以“Principles and Protocols For Post-Cryopreservation Quality Evaluation of Stem Cells in Novel Biomedicine”为名发表在《Frontiers in Pharmacology》上。本文亦为用于干细胞制剂质量控制的质量检测方案提供参考，并为未来的质量控制和冷冻保存研究提供指导。
干细胞的冷冻保存
冷冻损伤是细胞在冷冻或解冻过程中可能遭受的不可逆损伤，主要分类为渗透损伤，机械损伤和氧化损伤（图1）。
图1. 冷冻保存导致的干细胞损伤
一般来说，干细胞冷冻保存的步骤如下: 收集感兴趣的干细胞，仔细洗涤并重悬于合适的培养基中，然后加入含有一种或多种冷冻保护剂（CPAs）的冷冻保存溶液。到目前为止，二甲基亚砜（DMSO）是干细胞冷冻保存的首选冷冻保护剂（CPAs），通常以 5-10%（v/v）的最终浓度施用。装有细胞和促进存活添加剂的冻存管接着被冷冻至-80 °C，使用程序降温仪，通常以每分钟 -1 至 -3°C 的最佳冷却速率操作。最后，将冷冻样品置于液氮罐中，大部分在 -196°C 下进行长期保存。根据需要，干细胞在 37℃ 的水浴中迅速解冻，在给病人用药之前去除冷冻保护剂（CPAs）。
尽管注射冷冻保存的干细胞产物的不利影响的机制尚未完全解开，但除了二甲基亚砜（DMSO） 的毒性之外，其他促成因素包括细胞聚集和凋亡碎片的存在，注射悬浮液的体积和无核细胞的存在，细胞悬浮液的低温条件和电解质不平衡。可以预见的是，减少二甲基亚砜（DMSO）在冷冻保存中的添加量会减少不必要的副作用。
干细胞制备质量控制的关键方面
干细胞产品的生产应符合 GMP。对于干细胞产品的生产和临床应用没有统一的全球指南。美国FDA、欧洲 EMA、日本 PMDA 及其他监管机构现在均提供 GMP 以促进病人安全使用治疗方法。中国已经相继提出了适用于干细胞研究和生产的一般要求。
细胞特性分析
一些用于表征和鉴定干细胞类型的重要方法包括短串联重复序列（STR）分型、形态学检查、标记物鉴定、体外分化分析和畸胎瘤形成。
生物安全分析
干细胞的致瘤性是阻碍其临床应用的主要因素之一。包括细菌，真菌，支原体和细菌内毒素污染在内的干细胞产物的微生物污染是导致大量不良反应病例的原因。因此，临床应用之前进行微生物学检测与预防不良反应是相关的。此外，应该结合体内和体外方法，根据每种干细胞制剂的特点，测试人源和动物源的特定致病因子。比如使用了牛血清，应进行牛源性特异性病毒的检测。
生物活性分析
不同类型干细胞的生物学效应基本上可以根据它们诱导分化、免疫调节和组织再生的能力进行分类。生物效力测定包括: 相关生物活性物质的分泌（如重组蛋白，糖蛋白或脂蛋白，生长因子，酶和细胞因子），细胞外间质/结构，细胞相互作用（如免疫激活或抑制），细胞的迁移分化或自我更新潜力。
对于间充质干细胞（MSCs），无论其来源如何，应对多种细胞类型（例如脂肪细胞，软骨细胞，成骨细胞等）的分化能力进行体外测试，以确定其细胞分化的多能性。
质量控制的未来研究和方向
有效的冷冻保存解决方案
使用高效和低毒的冷冻保存方案来减少低温损伤将保证解冻后干细胞制备应用的有效性。
消除残余未分化干细胞
残留的未分化人类诱导多能干细胞（hiPSCs）构成致瘤风险，消除这些未分化人类诱导多能干细胞（hiPSCs）的方法对于确保安全性至关重要。
多能干细胞中线粒体脱氧核糖核酸的完整性
线粒体脱氧核糖核酸突变发生率很高，导致一些使生命衰弱和威胁生命的疾病。人们需要进行更多的研究，以发现其他不可调和的因素，了解这些 DNA 改变背后的机制，以及在人类使用干细胞之前评估线粒体脱氧核糖核酸和基因组 DNA 的完整性。
新的细胞遗传学技术
目前，一系列敏感的细胞遗传学工具，如荧光原位杂交、阵列比较基因组杂交、Giemsa（GTG）核型分析和全基因组测序已被开发用于评估干细胞的基因组完整性。单细胞基因组测序可以快速有效地检测大细胞样品中的遗传异质性。单细胞 RNA-seq 已经与电生理学结合用于评估人类诱导多能干细胞（hiPSCs）衍生的神经元的活性。类似地，单细胞测序已经应用于人群中癌症发展、进展和多样性趋势的长期监测。
文章来源：
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35592426/
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