冻融过程会对精子质量造成不可逆转的损害。这些损害可能来自于渗透压的改变、活性氧（ROS）或冰晶形成的机械损害，这不仅破坏了质膜，还导致平衡失调和抗氧化酶的泄漏。因此，有必要在冷冻过程中保护精子免受冷冻损伤。但冷冻保护剂可能会导致表观遗传学的改变或对配子产生毒性作用，从而降低受精能力，有必要密切关注开发新的冷冻保护剂，以期有更好的效率和更少的毒性。
讨论
文章来源：
青岛农业大学动物科技学院朱振东教授团队研究了CPLL（Carboxylated ε-Poly-L-lysine，羧基化ε-聚-L-赖氨酸）作为一种新型的冷冻保护剂，对山羊精子的质量、线粒体活性、抗氧化防御机制和解冻后的细胞凋亡的影响。研究结果以“Carboxylated ε-Poly-L-lysine Improves Post-Thaw Quality， Mitochondrial Functions and Antioxidant Defense of Goat Cryopreserved Sperm”发表在《Biology》上。
CPLL对精子活力参数的影响
用CASA对精子的运动模式进行了评估，结果发现，在冷冻介质中添加1%的CPLL可以改善山羊精子解冻后的运动能力参数。1%的CPLL补充组的VSL、VCL和VAP显示出比其他剂量更好的效果。只有1%CPLL补充组的精子的WOB（%）显著增加。
图1.在冷冻介质中补充0%至2.0%的CPLL对解冻后山羊精子膜完整性（A）和顶体完整性（B）的影响。
CPLL对线粒体膜电位和ATP水平的影响
由于1%的CPLL处理的精子显示出更好的膜和顶体的完整性，所以只对补充了1%的CPLL的精子的线粒体膜电位（MMP）进行了评估。图2A-D显示了MMP的荧光，MMP的流式细胞仪分析见图2E-G。如图2G所示，冷冻解冻的精子的MMP在1%CPLL处理组中明显增加。0.5%和1%的CPLL补充剂明显增加了解冻后精子的ATP含量，在1.5%组和对照组之间观察到类似的ATP含量，如果CPLL的补充量增加到2%，则ATP含量显著下降（图2H）。
图2. （A-D）荧光显微镜下观察使用或不使用CPLL冷冻的解冻后山羊精子的线粒体膜电位（MMP），其中蓝色箭头表示高MMP，黑色箭头表示低MMP。（E，F）流式细胞仪中的MMP荧光发射，（G）补充1%CPLL时的MMP与对照组的比较。（H）在冷冻培养基中补充0%至2.0%的CPLL对山羊精子ATP含量的影响。
CPLL对精子ROS水平和丙二醛含量的影响
同样，实验只在最佳CPLL浓度（1%）组测量精子中的ROS生成，结果显示，补充1%的CPLL显示冷冻解冻精子的ROS含量有明显的减少（图3A，B）。1%的CPLL处理显示出最低的丙二醛（MDA）水平（图3C）。
慢速冷冻涉及到细胞特定的冷却速率，以避免过度的溶质效应和细胞内冰的形成（图3a）。
图3.CPLL对山羊精子冷冻-解冻后ROS含量和MDA水平的影响。（A）ROS的流式细胞仪峰值；（B）1% CPLL和对照组的ROS含量比较。（C）在冷冻介质中补充不同浓度的CPLL时的MDA水平。
CPLL对精子GSH水平、SOD和CAT活性的影响
为了评估CPLL的抗氧化潜力，我们测量了解冻后精子的GSH水平、SOD活性和CAT活性。据观察，补充0.5%的CPLL可显著提高解冻后精子的GSH水平，增加到1%的水平后，GSH水平进一步显著提高。然而，进一步添加到1.5%和2%的CPLL，GSH水平明显下降（图4A）。与对照组相比，在冷冻培养基中加入1%和1.5%的CPLL，SOD活性明显增加，但1%的CPLL处理显示SOD活性比对照组高出近五倍（图4B）。只有1%的CPLL补充剂使解冻后精子的CAT活性显著提高（图4C）。
图4.同浓度的CPLL在冷冻介质中对解冻后山羊精子的抗氧化防御机制的影响。（A）GSH水平，（B）SOD活性，和（C）CAT活性。GSH：谷胱甘肽；SOD：超氧化物歧化酶；CAT：过氧化氢酶。
CPLL对解冻后精子凋亡的影响
用Western blot方法检测精子的凋亡，包括Caspase-3、Caspase-9、BCL-2和Bax，以Tubulin为对照（图5A）。据观察，1%和1.5%的CPLL组的Caspase-3和Caspase-9的表达明显下降（图5B，C）。添加1%和1.5%的CPLL到扩展剂中，可显著提高冻融精子中BCL-2的表达量（图5D）。
图5.通过Western blot检测解冻后山羊精子中的细胞凋亡相关蛋白。（A）使用Gel-Pro分析仪分析的条带强度。（B-E）蛋白质在管蛋白（内部对照）上的定量表达。
讨论
近年来，CPLL已被开发为一种新的非渗透性冷冻保护剂。CPLL是一种复杂的分子，由ε-聚L-赖氨酸（ε-PL）和琥珀酸酐的两性聚合物组成，形状为六边形或双锥体，可以改变大冰晶的形态，并能去除小冰晶。此外，聚赖氨酸溶液中的多阳离子分子和CPLL的糖蛋白分子容易吸附在细胞的亲水表面。因此，内部产生负压，将细胞内的水分向外渗出，减少冰晶的形成，保护细胞不受膜损伤。
在这项研究中，研究者着重研究了CPLL对山羊精子冷冻保存的影响，并探讨了其最佳浓度。本研究显示，考虑到山羊精子的运动能力、膜和顶体的完整性、线粒体的活性以及解冻后的抗氧化能力，在精子冷冻介质中补充1%的CPLL显示出最佳效果。1%的CPLL可作为山羊精子冷冻保存的有效冷冻保护剂。
文章来源：
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36829509/
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