冷冻储存和冷链运输是提高水产品保质期的有效方法，这导致了冰晶的生长和细胞的损伤，添加低温保护剂对这一问题有积极作用。然而，过甜、高热量、用量大等缺点限制了冷冻保护剂的应用。
大连民族大学生命科学学院的李婷婷教授团队和中国农业科学院的谭志坚研究员团队，通过用胃蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶水解P. crocea蛋白质来制备多肽，以评估P. crocea多肽的影响。该研究可为促进水产品解冻后的质量提供技术支持，并可为防冻肽的深入研究和应用提供理论和实验依据。
防冻肽的筛选
研究者用液相色谱法测定了P. crocea的三种多肽的MWD（图1）。结果显示，三种肽在分子量小于3000Da的部分中占很大比例，这表明胶原蛋白与酶相互作用，产生具有抗冻作用的可控水解物。
图1.（a）三种P. crocea肽的分子量分布和（b）液相色谱图。
图1.（a）三种P. crocea肽的分子量分布和（b）液相色谱图。
三种肽的体外抗氧化活性通过四个指标进行了综合评估，胰蛋白酶水解物对自由基的清除效果最好，明显高于胃蛋白酶水解肽和中性蛋白酶水解肽（图2）。
图2.（a）三种肽的DPPH自由基清除率，（b）ABTS自由基清除率，（c）羟基自由基清除率，以及（d）超氧阴离子产生率。
最后根据分子量、氨基酸分析、抗氧化剂和质地的结果，选择胰蛋白酶水解物用于进一步研究。
物理特性的测定
电子鼻是一种可以获得挥发性化合物特征的规格化仪器，通过提取每个传感器的响应值，建立了不同样品的气味雷达图。发现水产品中的挥发性物质主要包括醛类和酮类，这也是腥臭味的主要来源（图3a）。
用电子舌分析了冻融循环后的五种鱼肉的基本味道。在鲜味方面，经过三次冻融循环后，各组与FF相比都有所下降，但胰蛋白酶水解物对保持样品的鲜味效果最好。在甜味方面，由于添加了大量的蔗糖，相关组的样品在三次冻融循环后仍显示出较高的甜味值，这也是商业冷冻保护剂应用于水产品时最明显的缺点（图3b）。
图3. 不同处理方式下冻融循环引起的（a）电子鼻和（b）电子舌的分析。备注：FF（新鲜鱼片）；Control（新鲜鱼片浸泡在水溶液中，作为阴性对照）；PH（新鲜鱼片浸泡在2mg/mL胃蛋白酶水解液中）；TH（新鲜鱼片浸泡在2mg/mL胰蛋白酶水解液中）；NP（新鲜鱼片浸泡在2mg/mL中性蛋白酶水解物中）；CP（新鲜鱼片浸泡在4%（w/v）商业低温保护剂（4%（w/w）蔗糖）中，作为阳性对照）；TH-CP（新鲜鱼片浸泡在2mg/mL TH和4% CP混合溶液中）。
圆二色性
在蛋白质的二级结构中，最有序和稳定的是α-螺旋结构，而β-转体和无规线圈是无序结构。Control组的α-螺旋含量下降，变成了β-片状、β-圈状和随机线圈（图4b）。
图4.（a）圆二色性，（b）二级结构内容，（c）荧光光谱，和（d）不同处理下冻融循环诱导的肌纤维蛋白的紫外线二次衍生物。
图4.（a）圆二色性，（b）二级结构内容，（c）荧光光谱，和（d）不同处理下冻融循环诱导的肌纤维蛋白的紫外线二次衍生物。
荧光光谱法+紫外吸收光谱法
内源性荧光、紫外吸收光谱是确定蛋白质三级构象的关键技术方法。与实验组相比，Control组的肌膜蛋白的最大荧光峰位置（INmax）有蓝移现象（向短波方向移动），且Control组在紫外吸收光谱296.5nm处的吸收峰出现了蓝移现象，说明在冻融循环中，蛋白质变性，色氨酸所在环境的极性增加，导致表面疏水性增加（图4c、4d）。
测定MFP的表面疏水性
如图5a所示，用胰蛋白酶水解物和商业冷冻保护剂溶液制备的样品在三个冻融循环后具有最低的SoANS，而Control组具有最大的SoANS。SoANS的上升反映了Ca2+-ATP酶活性的下降（图5f）。这表明从鱼糜中分离出来的MFP的疏水结构由于构象变化而暴露出来。导致鱼糜蛋白变性的主要原因是冰晶的形成和冷冻储存期间结合水的解离。
图5. 不同处理对（a）表面疏水性（So-ANS）的影响，（b）Zeta电位和粒度，（c）羰基含量，（d）二聚酪氨酸含量，（e）蛋白质溶解度，总巯基含量，和（f）冻融循环诱导的MFP的Ca2+-ATP酶活性。
Zeta电位和颗粒大小
由图5b可见，用胰蛋白酶水解物进行浸泡预处理可能会抑制蛋白质的聚集（有效颗粒直径值有所下降），提高解冻后的蛋白质溶液体系的稳定性，这与商业冷冻保护剂的效果相当。
羰基含量
羰基浓度代表了蛋白质氧化的水平，根据图5c，Control组样品的羰基含量明显高于其他组，这主要是由于在冻融过程中，挤压、扭曲和细胞断裂造成的冰晶发展。
二聚体含量
二聚体含量被确定为蛋白质氧化的具体指标之一。如图5d所示，与Control组相比，TH组的双硫氨酸含量明显较低。结果表明，将小鼠浸泡在胰蛋白酶水解液中可减少蛋白质的氧化和交联。
T-SH含量
T-SH含量是蛋白质氧化的一个可靠指标。如图5e所示，在三个冻融周期后，Control组具有最大的巯基含量，表明在这种聚集中蛋白质氧化的严重程度，可以从冻融周期中冰晶的产生和再结晶中推断出来。
蛋白质溶解度
图5e描述了鱼糜的蛋白质溶解度的变化。与FF相比，所有处理组的蛋白质溶解度都有所下降，但与Control组相当。这表明，胰蛋白酶水解物保持了蛋白质溶解度。
Ca2+-ATP酶的活性
Ca2+-ATP酶的激活证明了肌球蛋白头部的结构完整性。从图5f可以看出，在TH和CP组中，Ca2+-ATP酶的活性较高，表明它们具有限制冰晶对肌肉细丝的损害、减少蛋白质氧化水平的特性。
结论
P.crocea蛋白的胰蛋白酶水解液显示了体外自由基清除活性。在浸泡鱼糜时，水解物有效地延缓了肌纤维蛋白的氧化和聚集，稳定了二级结构和三级结构，并保持了颜色、持水能力和质地特性。此外，与4%的蔗糖相比，水解物处理可以有效地降低甜度，并提高鲜味。总的来说，P. crocea蛋白的胰蛋白酶水解物可以取代传统的商业冷冻保护剂，成为水产品的天然冷冻保护剂。
文章来源：
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36832950/
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