公鸡精子的冷冻保存对遗传资源的保护、遗传改良和提高生产力非常重要。由于公鸡精子的独特结构，一般的冷冻保护剂不能有效抑制冻融过程中冰晶的形成和再结晶，无法有效保护精子。基于以往研究，推测添加外源重组 RhoA 蛋白可能通过 Rho/ROCK 途径有效提高动物精子的冷冻保护。
北京农学院动物科学技术学院齐晓龙副教授团队，研究探索 RhoA 重组蛋白对公鸡精子在冻融过程中的冷冻保护和亚细胞结构的影响，并阐明 RhoA 潜在的冷冻保护机制。相关研究以“RhoA improves cryopreservation of rooster sperm through the Rho/RhoA-associated kinase/cofilin pathway”为题发表在《 Poultry Science》上。
冷冻前和冷冻后的精子质量
研究者在冷冻保护剂中加入不同数量的 RhoA 重组蛋白，观察到 RhoA 在冷冻前不影响精子活力、运动能力、线性指数（linearity index）和线性速度（linear velocity）。在冷冻保护剂中加入 0.5 和 1mg/mL 的 RhoA 重组蛋白，使精子冻融后的存活率、活力、线性指数和线速度都有明显增加。
冷冻复苏前后精子顶体的完整性
在冷冻前，加入不同水平的 RhoA 并不影响精子顶体的完整性。在冷冻保护剂中加入 0.5mg/mL 的 RhoA 重组蛋白，与对照组相比，冻融后的精子顶体完整性显著增加（图1）。
图1.添加 RhoA 对冷冻和复苏后精子顶体完整性的影响。（A）精子的顶体是完整的。（B）精子的顶体不完整。（C）冷冻前精子的顶体完整性。（D）冷冻和复苏后精子的顶体完整性。
图1.添加 RhoA 对冷冻和复苏后精子顶体完整性的影响。（A）精子的顶体是完整的。（B）精子的顶体不完整。（C）冷冻前精子的顶体完整性。（D）冷冻和复苏后精子的顶体完整性。
冷冻复苏后的精子超微结构
研究发现，在添加外源 RhoA 后，公鸡精子头部、颈部和尾部表现出不同程度的细胞骨骼损伤（图 2、图 3）。
图2. 冷冻和复苏后精子整体超微结构的变化。（A）超微结构完整的公鸡精子（未添加 RhoA 重组蛋白）。（B）精子头部破裂，细胞质溢出（加入 0.5mg/mL 的 RhoA 重组蛋白）。（C）精子头部破裂（加入 0.1mg/mL 的 RhoA 重组蛋白）。（D）超微结构完整的精子头（未添加 RhoA 重组蛋白）。（E）精子顶体的膜结构被破坏（未添加 RhoA 重组蛋白）。（F）精子连接片的整体超微结构（加入 1mg/mL 的 RhoA 重组蛋白）。（G）精子轴丝中的 9 条双管被分离（未添加 RhoA 重组蛋白）。（H）没有冷冻损伤的精子鞭毛（没有添加 RhoA 重组蛋白）。（I）头部断裂的精子（加入 0.5mg/mL 的 RhoA 重组蛋白）。
对精子的结构进行了定量分析结果显示，加入 0.5mg/mL 和 1mg/mL 的 RhoA，与对照组相比，冻融后顶体核膜、质膜和精子尾部的破损率明显下降（图4）。
图4.不同水平的 RhoA 对冻融精子的超微结构的影响。（A）精子尾部损伤的数量%。（B）顶体质膜损伤的数量%。（C）核膜破坏的数量%。
Y-27632对精子冷冻的影响
与对照组相比，加入 0.5mg/mL RhoA 后，冻融后 ROCK1 和 P-cofilin 的蛋白表达水平明显提高，而切丝蛋白的蛋白表达水平则明显下降。加入 Y-27632，ROCK1 和 P-cofilin 的蛋白表达水平明显下降，而丝切蛋白的蛋白表达水平明显上升。在不同的处理组中加入 Y-27632，与对照组相比，精子的活力、存活率和顶体的完整性明显下降。加入 Y-27632 对精子冷冻的影响总结于图5。
图5. Y-27632 对精子冷冻保护的影响。（A）添加 Y-27632 对 RhoA 下游蛋白 ROCK1、cofilin 和 P-cofilin 的蛋白表达的影响。（B）ROCK1 的相对表达（ROCK1/GAPDH）。（C）P-cofilin 的相对表达（P cofilin/cofilin）。（D）Y-27632 对冷冻和复苏后精子活力的影响。（E）Y-27632 对冷冻和复苏后精子存活率的影响。（F）Y-27632 对冷冻和复苏后精子顶体完整率的影响。（G-I）Y-27632 对冷冻和复苏后精子超微结构的影响的定量统计。每个重复组统计 200 个以上的精子。（G）Y-27632 对冷冻和复苏后精子尾部损伤数量的影响。（H）Y-27632 对冷冻和复苏后顶体质膜损伤数量的影响。（I）Y-27632 对冷冻和复苏后核膜损伤数量的影响。
讨论
研究者证明了精子冻融过程中涉及 Rho/ROCK 途径的低温保护机制，并发现外源性添加重组 RhoA 蛋白可以通过该途径改善精子冻融后的运动能力、生存能力、顶体完整性和亚细胞超微结构。Rho/ROCK 的途径可能通过调节丝切蛋白的磷酸化水平影响肌动蛋白和细胞骨架的动态重组（图6）。
图6. 公鸡精子冷冻保护中 RhoA 途径的示意图。
图6. 公鸡精子冷冻保护中 RhoA 途径的示意图。
这种方法从提高精子自身的抗冻能力（而不是减少外部环境造成的物理损伤）入手，为提高精子低温保存的质量提供了新的思路。
文章来源：
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35961254/
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