三疣梭子蟹是一种著名的大型海洋经济蟹，具有很高的营养价值和药用价值。然而，水产养殖环境急剧恶化，天然种质资源严重退化，种质资源的保护已成为三疣梭子蟹养殖业急需解决的重大问题，目前最成熟的方法是精子和卵子的冻存技术。
宁波大学的侯聪聪副教授团队通过筛选各种精子获取方法和冷冻保护剂组合，针对三疣梭子蟹选择最佳的冷冻保存方法，为三疣梭子蟹的繁殖调节和育种提供科学依据。该研究以“Optimization of Sperm Cryopreservation Formulation in Portunus trituberculatus”为题发表再《International Journal of Molecular Sciences》上。
精子采集
甲壳类动物的精子以精子囊的形式成熟，要获得游离精子，必须破坏精囊。研究者用胰蛋白酶消化法获得的三疣梭子蟹90%以上的游离精子都进行了顶体反应，精子存活率为8.2%；用搓网法获得的游离精子60%以上是正常的，精子存活率为64.3%；用机械研磨法获得的精子被严重损坏，精子存活率为10.7%，几乎所有的精子都在冷冻后死亡。与其他两种方法相比，搓网法操作简单，对精子的损伤最小，精子畸形率低。
精子的形态学评估
研究者观察到I型活精子没有发生顶体反应，球形精子缺乏鞭毛，但有激进的手臂。II型精子的顶体被反转。III型精子的顶体是倒置的。IV型精子的顶体形态仍然正常，但整个精子被染成红色。
图1.在光镜下观察活精子和死精子的情况。（a）活精子。（b）有顶体反应的活精子。（c）有顶体反应的死精子。（d）死精子。红色箭头：顶体。黄色箭头：细胞核。白色箭头：激进的手臂。
不同种类和浓度的冷冻保护剂的影响
三疣梭子蟹精子在不同类型和浓度的冷冻保护剂中的存活率有明显的差异。在六个不同的浓度组中，甘油都比其他冷冻保护剂好。其中，20%的甘油是最有效的冷冻保护剂，精子存活率为41.79%，明显优于其他浓度的甘油（图2）。
图2.应用不同种类和浓度的冷冻保护剂后三疣梭子蟹精子的存活率。Gly：甘油，DMSO：二甲亚砜，MeOH：甲醇，EG：乙二醇，PG：丙二醇。
图2.应用不同种类和浓度的冷冻保护剂后三疣梭子蟹精子的存活率。Gly：甘油，DMSO：二甲亚砜，MeOH：甲醇，EG：乙二醇，PG：丙二醇。
在4℃下不同平衡时间的影响
三疣梭子蟹的冷冻精子在不同平衡时间下的存活率有显著差异。4℃下平衡15分钟的冷冻效果最好，明显高于其他组，精子存活率为40.98%。没有平衡直接输入液氮的实验组效果最差。缩小时间梯度后，15分钟仍是最佳平衡时间（图3）。低温保护剂与精液混合一段时间后，有利于发挥低温保护剂的作用。
图3.三疣梭子蟹的精子在不同平衡时间后的存活率。（a）0、10、20、30、40、50、60、70和80分钟后精子的存活率。（b）5、10、15、20和25分钟后精子的存活率。
不同冷却程序对低温保存的影响
结果显示，最合适的冷却高度是吸管水平放置在液氮表面以上3.5厘米。在液氮表面上方3.5厘米处停留15分钟效果最好，精子存活率为44.79%（图4）。
图4.三疣梭子蟹的精子在低温保存时经过不同的冷却程序后的存活率。
图4.三疣梭子蟹的精子在低温保存时经过不同的冷却程序后的存活率。
不同解冻温度的影响
在不同的解冻温度下，冷冻精子存活率最好的是42℃的水浴，精子存活率可以达到49.44%，其次是37℃的水浴，精子存活率为45.56%（图5）。
图5. 三疣梭子蟹的精子在低温保存时经过不同的复苏温度后的存活率。
图5. 三疣梭子蟹的精子在低温保存时经过不同的复苏温度后的存活率。
不同冷冻时间对低温保存的影响
在同样的冷冻条件下，在1-30天内检测冷冻保存的精子的存活率，基本稳定在50%，无明显差异（图6）。
图6. 不同冷冻时间后三疣梭子蟹精子的存活率。
图6. 不同冷冻时间后三疣梭子蟹精子的存活率。
新鲜和冷冻精子的基因表达和酶活性分析
qPCR结果显示，冷冻精子中精子相关基因ALF、DIC、caspase 1和顶体蛋白的表达明显下降（图7）。ALF、DIC、Caspase 1和顶体蛋白可以作为反应精子活力的标志物。因此，精子低温保存会对三疣梭子蟹的精子造成一定的损害。
图7. 三疣梭子蟹新鲜和冷冻精子中精子相关基因的表达。（a）Aalpha/beta-like factor（ALF）的表达。（b）DIC的表达。（c）caspase 1的表达。（d）顶体蛋白的表达。
图9. 三疣梭子蟹的精子冻存保存程序流程图
图7. 三疣梭子蟹新鲜和冷冻精子中精子相关基因的表达。（a）Aalpha/beta-like factor（ALF）的表达。（b）DIC的表达。（c）caspase 1的表达。（d）顶体蛋白的表达。
与三疣梭子蟹新鲜精子相比，冷冻精子中总超氧歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、还原型谷胱甘肽（GSH）、酸性磷酸酶（ACP）和碱性磷酸酶（AKP）的酶活性明显下降（图8）。
图8. 新鲜精子和冷冻精子的酶活性分析。
图8. 新鲜精子和冷冻精子的酶活性分析。
结论
研究本研究通过筛选不同的精子获取方法和冷冻保护剂组合，选择最适合三疣梭子蟹的冷冻保存方法（图9），改善三疣梭子蟹的繁殖基础，保证精子供应不受时间和空间的限制，为人工体外受精提供基础知识。
图9. 三疣梭子蟹的精子冻存保存程序流程图
该研究在保护物种多样性方面具有广泛的研究意义和应用前景。对完善三疣梭子蟹的种质资源、提高水产养殖产量具有重要意义。同时，本研究为建立甲壳类动物的精子冻存库提供了一定的技术基础。
文章来源：
https://www.mdpi.com/1422-0067/24/5/4358
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